MAKALAH
“ELISA”
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )
OLEH: KELAS 16 C ANALIS
KESEHATAN
DOSEN : AGNES RANTESALU,
KELOMPOK 8
ELISA ;
v KAHARUDDIN
NIM : 16 3145
453 097
v WARDANIA
NIM : 16 3145
453 118
v IMAM UTOMO
NIM : 16 3145
453 094
PROGRAM STUDI
DIPLOMA III ANALISIS KESEHATAN
SEKOLAH TINGGI
ILMU KESEHATAN
MEGA REZKY
MAKASSAR
2016/ 2017
KATA PENGANTAR
Bismillahi Rahmani
Rahim
Alhamdulillah puji dan syukur kita
panjatkan kehadirat Allah SWT, karena
rahmat dan hidaya-lah, kami dari kelompok 8 ( delapan ) ELISA dapat
menyelesaikan makalah ini walaupun dalam makalah tersebut masih jauh dari
kesempurnaan.
Makalah ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu,
sepatutnyalah penulis menyampaikan ucapan terima kasih dan penghargaan yang
setinggi-tingginya kepada berbagai pihak yang turut memberikan andil, baik
secara langsung maupun tidak langsung, moral maupun material.
Akhirnya kami dari kelompok 8 Elisa, dengan segala kerendahan hati
mohon pamit serta maaf yang setulus tulusnya atas kekurang sempurnaan makalah
yang kami buat ini.
Amin Ya Rabbal ‘Alamin
Wassalamu ‘Alaikum Wr. Wb.
Makassar,
Oktober 2016
Kelompok
8 Elisa
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i
KATA PENGANTAR ........................................................................................... ii
DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii
BAB I PENDAHULUAN ....................................................................... 1-2
A.
Latar Belakang Masalah ........................................................ 1
B.
Rumusan Masalah................................................................. 2
C.
Tujuan................................................................................... 2
BAB II PEMBAHASAN.......................................................................... 3-10
A.
Definisi..................................................................................... 3
B.
Jenis- jenis ELISA (Enzyme-Linked Immune-Sorbent
Assay) ... 4- 7
C.
Prinsip kerja ELISA (Enzyme-Linked
Immune-Sorbent Assay).. 7- 8
D.
Cara kerja ELISA (Enzyme-Linked
Immune-Sorbent Assay)...... 8- 9
E.
Kelebihan dan kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immune-
Sorbent Assay).......................................................................... 9- 10
BAB III PENUTUP ............................................................................... ... 11
A.
Kesimpulan........................................................................... 11
B.
Saran .................................................................................... 11
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 12
BAB
I
PENDAHULUAN
A.
Latar belakang
Praktikum
biologi molekuler diawali dari isolasi DNA untuk memisahkan DNA dari sel suatu
individu. Selanjutnya dilakukan proses spektrofotometri untuk mengetahui
kemurnian DNA tersebut. Tahap selanjutnya yaitu amplifikasi dengan teknik PCR.
DNA kemudian dielektroforesis dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari RNA dan
pengotor lain. Tahap berikutnya yaitu digesti untuk memotong sekuen DNA
spesifik yang diinginkan. kemudian dilakukan sequencing. Dari semua tahapan yang dilakukan, masih
terdapat satu langkah lagi yaitu ELISA yang berguna untuk mengetahui jumlah
atau konsentrasi sampel yang didapatkan.
Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik biokimia untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Penggunaan ELISA melibatkan
setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. ELISA
terdiri atas tiga macam yaitu Direct
ELISA, Indirect ELISA, dan Sandwich
ELISA (Baker dkk.
2007: 211).
Direct ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur
konsentrasi suatu antigen. Antigen yang akan dideteksi akan berikatan langsung
(direct) dengan antibodi detector (antibodi yang telah dilabeli
oleh enzim reporter). Antibodi yang
digunakan pada teknik direct ELISA
berjumlah satu buah. Kelebihan dari direct ELISA yaitu Cepat dan tidak terdapat Cross Reaksi dengan
antibodi sekunder. Akan tetapi, direct ELISA memiliki kekurangan yaitu harga
pelabelan antibodi primer yang mahal, tidak ada fleksibilitas pemilihan
antibodi primer, dan sinyal amplifikasinya sedikit (Walker & Rapley
2008: 668).
Indirect ELISA merupakan jenis ELISA yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur
konsentrasi antigen atau antibodi. Teknik tersebut memiliki karakteristik yaitu
antigen tidak menempel langsung pada antibodi detector (indirect). Antigen akan berikatan dengan
antibodi lain terlebih dahulu. Antibodi tersebut kemudian akan berikatan dengan
antibodi yang telah dilabeli. Kelebihan indirect ELISA yaitu memiliki
sensitivitas tinggi dan sinyal amplifikasi yang tinggi. Kekurangan indirect
ELISA yaitu membutuhkan waktu yang lama dan terjadi cross reaksi terjadi
(Walker & Rapley 2008: 669).
Sandwich direct ELISA menggunakan dua antibodi yaitu antibodi penangkap dan antibodi yang
dilabeli enzim. Antigen yang telah berikatan dengan antobodi penangkap akan
berikatan kembali dengan antibodi yang dilabeli enzim. Sandwich indirect ELISA menggunakan tiga antibodi yaitu antibodi
penangkap, antibodi detektor, dan anti-antibodi yang dilabeli enzim. Antigen
yang telah berikatan dengan antibodi penangkap akan berikatan dengan antibodi
detektor dan anti-antibodi yang dilabeli enzim (Crowther 1995: 39). Antigen
dalam sandwich ELISA tidak perlu dimurnikan sebelum digunakan. Sandwich ELISA
sangat spesifik sehingga tidak semua antibodi dapat digunakan.
B.
Rumusan masalah
Berdasarkan latar belakang yang ada maka rumusan masalah yang dibahas
dalam makala ini adalah :
1. Apa itu
ELISA?
2. Bagaimana Jenis-jenis ELISA ?
3. Bagaimana prinsip kerja dari metode ELISA ?
4. Bagaimana contoh cara kerja metode ELISA ?
5. Apa kelebihan dan kekurangan dari metode ELISA ?
C.
Tujuan
Adapun tujuan dari pembuatan tulisan ini adalah :
1. Menambah ilmu pengetahuan tentang Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
2. Memahami lebih dalam tentang apa itu “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”.
3. Memenuhi tugas dalam mata kuliah instrumentasi.
Adapun tujuan dari pembuatan tulisan ini adalah :
1. Menambah ilmu pengetahuan tentang Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
2. Memahami lebih dalam tentang apa itu “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”.
3. Memenuhi tugas dalam mata kuliah instrumentasi.
BAB II
PEMBAHASAN
A.
Definisi
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
atau yang sering disebut uji kekebalan enzimatis
adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang
imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi
tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu
permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu
enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh
enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya
dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/ antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat
disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau
spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk
antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen
diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan
antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat
dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan
enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci
dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi
yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan
substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang
menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama
menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan
substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif
.
B. Jenis- jenis ELISA (Enzyme-Linked Immune-Sorbent Assay )
1.
Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum
adalah:
1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya
ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut
akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari
konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang
digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan
diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine
serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate
mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein
serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi
dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer
yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi
antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi
protein total harus sama dengan antigen standar.
4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen
yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
protein yang terbloking.
5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan
dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan
substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi
yang tidak terikat.
7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau
alat optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi
terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai
molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode
imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan
menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang
kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan
pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada
gambar di bawah ini.
2. Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak
terikat
5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan
antigen
6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer.
7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak
terikat dapat dibuang.
8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia.
9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari
antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya
menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen
yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein
pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh
permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip
kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
3. ELISA kompetitif
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah
dibahas sebelumnya, yaitu:
1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya
2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah
dilapisi antigen
3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin
banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada
antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi
4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi
sekunder ini berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal
kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal,
semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada
gambar berikut ini:
C. Prinsip Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai
berikut :
Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji
ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut
dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan
adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen
atau antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich).
Selanjutnya antibodi atau antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu
enzim signal (disesuaikan dengan sampel => bila sampel berupa antigen, maka
digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa antibodi, maka
digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga
dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian.
Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat
bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke
permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang
berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense
misalnya, enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.
D. Contoh Cara Kerja ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA, yaitu:
a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter
plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan membiarkan larutan berisi
antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik
dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik
(seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi
antibodinya dan membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc
pada antibody yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang
berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan secara
kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak
berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka
makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel.
b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1. Melapisi mikrotiter
plate dengan antibodi yang sudah dimurnikandimurnikan dengan membiarkan larutan
berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik
dilekati oleh antigen dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik
(seperti larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan
membiarkan antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim
dan bersifat spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga
terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak
berwarna yang terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki, maka
makin besar kadarantigen spesifi dalam sampel.
E. Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
1. Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
Ø Teknik pengerjaan relatif sederhana
Ø Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja,
sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
Ø Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
Ø Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau
antigen yang bersifat sangat spesifik)
Ø Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
2. Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
Ø Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya
jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
Ø Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal,
sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
Ø Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat
kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas
dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat
berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
Ø Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga
pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat
diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah metode
uji imunitas atau keberadaan dan konsentrasi suatu protein penyusun antigen
berdasarkan reaksi antara antibodi dan antigen itu sendiri. Teknik tersebut
tidak hanya dapat digunakan untuk mendeteksi antigen, tetapi dapat digunakan
untuk mendeteksi antibodi di dalam tubuh. Prinsip kerja dari teknik ELISA
adalah berdasarkan reaksi spesifik antara antibodi dan antigen dengan
menggunakan enzim sebagai penanda (marker).
Enzim tersebut akan memberikan suatu tanda terdapatnya suatu antigen jika
antigen tersebut sudah bereaksi dengan antibodi. Reaksi tersebut memerlukan
antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen.
B. Saran
Adapun
kesimpulan pada makalah ini yaitu semoga adanya makalah ini bisa pulalah
menambah pengetahuan kita tentang ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
Dan mahasiswa yang ingin mengetahui lebih detail tentang ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay), diharapkan mencari lebih banyak referensi,sumber dari
berbagai buku karena makalah ini belum lah sempurna,sebab tak ada manusia yang
sempurna.
DAFTAR PUSTAKA
